mRNA技术作为一种新兴的生物技术，展现出巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这项技术为疾病的预防和治疗提供了崭新的方法。然而，mRNA技术的发展并不平坦，最主要的挑战之一是副产物双链RNA（dsRNA）的产生。dsRNA是一种免疫刺激分子，能够引发机体免疫反应，从而影响mRNA的安全性与有效性。因此，如何有效减少dsRNA的产生，成为mRNA技术领域亟待解决的关键问题。

传统的解决方案通常依赖复杂的纯化工艺，然而这些方法成本高、效率低，并且难以彻底去除微量dsRNA。T7RNA聚合酶（T7RNAP）作为mRNA体外转录（IVT）的核心工具，其天然活性，例如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性，被认为是dsRNA形成的关键因素。如何通过定向进化或理性设计对T7RNAP进行改造，成为全球科研团队竞相研究的焦点。

2024年3月3日，我们团队在FEBS Journal上发表了题为《Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》的研究论文。我们成功通过工程化改造T7RNAP，显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成，其水平仅为野生型的18%大幅提升了mRNA的整体效率和质量，推动了基因治疗和疫苗开发领域的飞跃性发展。

通过创新性地结合定向进化与半理性设计的方法，我们成功筛选出多个高效、低毒的T7RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA形成方面表现突出。我们构建了随机突变库，设计了一种可实时监测液滴内RNA产物完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，并利用荧光激活液滴分选（FADS）定向进化技术进行超高通量筛选。最终筛选出的关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T）的dsRNA含量显著低于野生型。

与此同时，我们使用半理性设计方法构建了十个单点饱和突变库，通过微孔板筛选技术识别有益突变体。在筛选超过1000个突变体后，发现关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）在dsRNA含量方面均显著低于野生型，并且未影响转录效率。

为了进一步优化，我们针对上述突变位点构建了DNA重组文库，并通过微孔板筛选技术最终获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验结果显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中达到了0.007 ng/μg的水平。这一结果不仅在体外实验中得到了验证，更在细胞实验中表现出显著的免疫原性降低及蛋白翻译效率的提升。

我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞中后，最优突变体M11产物诱导的干扰素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表达量仅为野生型的97%和1293 pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA引发的EGFP表达细胞数量显著增加，荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA能够有效解除PKR介导的翻译抑制，释放mRNA治疗的潜能。

为深入了解突变体降低dsRNA的机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示，突变体由于降低了RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性，导致dsRNA的降低。这一发现为未来进一步优化T7RNAP提供了重要的理论依据。

本研究为T7RNAP的改造提供了新的方法与思路，也为mRNA技术的进展注入了新活力。通过减少dsRNA的形成，提升了mRNA的质量和安全性。依靠此项研究成果，我们成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级别T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNA Polymerase GMP-grade（low dsRNA，250U/μL））。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等领域展示出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的快速发展，为生物医学领域带来更多可能性。

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